”
背景
炎性细胞因子的释放，在重症急性胰腺炎（SAP）局部炎症和全身并发症中起主导作用。高迁移率族蛋白1（HMGB1）参与了SAP的器官功能障碍和细菌移位机制。本研究旨在探讨HMGB1在SAP肠黏膜屏障功能障碍的可能作用和抗HMGB1抗体在治疗SAP肠黏膜损伤中的作用。我们的数据显示，雨蛙肽和LPS诱导的AP小鼠中HMGB1的表达显著增加，HMGB1的抑制在肠黏膜屏障功能中有保护作用，降低了血清促炎细胞因子包括IL-1β，IL-6，TNF-α等的水平。我们研究了HMGB1信号通路的下游受体发现，Toll样受体（TLR）4和TLR9在AP小鼠回肠表达升高，给予HMGB1中和抗体显著降低了TLR4和TLR9表达。因此HMGB1参与了AP时肠黏膜屏障功能障碍的机制。应用HMGB1中和抗体阻断HMGB1可能是改善SAP肠黏膜屏障功能障碍的有效治疗策略。
近年来的研究表明HMGB1可能是参与全身炎症反应和多器官损害的关键炎症介质。HMGB1可影响肠黏膜的生物学功能，并可能在SAP肠屏障损伤中发挥作用。HMGB1中和抗体能显著改善血清淀粉酶水平的升高与SAP胰腺和肺组织的病理改变。阻断HMGB1也能显著改善SAP患者血清丙氨酸氨基转移酶和肌酐的升高。但阻断HMGB1能否改善SAP的肠屏障损伤尚未见报道。因此，本研究的目的是探讨HMGB1在AP肠黏膜屏障功能障碍中的可能作用。并探讨多克隆抗体阻断HMGB1是否能改善肠黏膜屏障功能障碍，及其可能的作用机制。
方法
动物：购买体重20–25克的成年雄性KM小鼠，在西南医科大学实验动物中心（泸州，中国）进行饲养、繁育。10只/组，被安置在房间温度控制（21–24°C）和保持光/暗周期（12:12）1周来适应环境，使用自来水和常规饲料。在诱导AP前，小鼠禁食12小时，但可以自由饮水。动物实验由西南医科大学动物福利委员会批准，并遵守当地动物使用与管理委员会以及中国国家动物福利法。
ANP模型的建立和实验设计：小鼠随机分为四组：ANP组（仅ANP）、对照组、抗HMGB1组（HMGB1中和抗体治疗的ANP动物）和IgY组（非免疫鸡卵黄抗体治疗的ANP动物）。ANP小鼠模型诱导如先前描述。ANP小鼠使用蛙皮素（Sigma，美国）50μg／kg剂量，连续13小时腹腔注射（i.p.），随后用单剂量10mg/kg注射LPS。PBS注射液作对照。HMGB1中和抗体处理的小鼠注射LPS后腹腔注射μg剂量抗HMGB1抗体（Shino-Test，东京，日本）。抗HMGB1的中和活性用HMGB1刺激巨噬细胞培养的TNF释放来证实。在抗HMGB1抗体的存在下，中和抗体被定义为抑制80%HMGB1诱导TNF的释放。注射LPS后μg非免疫鸡卵黄抗体（筱测试，东京，日本）腹腔注射作为HMGB1中和抗体对照。研究在12小时后同时进行。
组织学检查：为了评估胰腺组织和回肠粘膜在形态学上的变化，胰腺和回肠组织在10%福尔马林缓冲液中固定过夜、乙醇脱水、石蜡包埋、组织标本切片（5μm）、HE染色，做常规组织学检查。
ELISA：注射LPS12小时后，通过心脏穿刺取血，收集血清，-80°C冻存，使用市售的酶联免疫吸附试剂盒（ELISA）（Neobioscience，北京，中国）测定IL-1β、IL-6、TNF-α、DAO、内毒素核心抗体。所有测试步骤严格按照制造商的规程，统计分析采用Mann-WhitneyU检验。
TUNEL：采用TUNEL试剂盒（罗氏诊断，瑞典）检测回肠黏膜细胞凋亡。回肠组织切片脱蜡、水化，在蛋白酶工作液中37°C孵育30分钟，做TUNEL反应。切片被放在一个含有毫升0.1-mol/l枸橼酸盐缓冲液（pH6）的塑料瓶中，用W微波照射5分钟。用PBS洗两次，用酶末端脱氧核苷酸转移酶和核苷酸混合物（标准液）组成的混合溶液在湿盒中37°C闭光60分钟。阴性对照加入50μL的标准液，然后加入到含50μL转化过氧化物酶的培养基中培养。二氨基联苯作为过氧化物酶的底物，将核染成特有的棕色。每一个测试包含阴性对照。通过最优图像分析系统计算凋亡细胞的整体光密度（IOD）测量值来表示半定量结果。
RT-PCR：根据制造商的方案使用总RNA提取试剂盒从存储回肠样品中提取总RNA（Tiangen生化科技，北京，中国），基因组cDNA的敲除和合成（PrimeScriptRTcDNA敲除试剂盒，大连，中国）。HMGB1、TLR4、TLR9mRNA表达水平使用SYBR、EXTaq酶混合体系实时定量PCR（Takara生物科技，大连，中国），iCycler热实时PCR系统（MJ研究机构，美国）测定。HMGB1、TLR4、TLR9的引物（Invitrogen公司，美国）基因扩增列于表1。结果至少在三个独立的RNA制剂中可重复。表达水平用正常化的actin作为内部控制基因，使用2-ΔΔCt方法进行分析。
点击可查看大图
Westernblotting：用Westernblot检测回肠HMGB1、TLR4、TLR9蛋白的表达。按说明书从核和细胞质中提取蛋白质（碧云天生物技术研究所，上海，中国）。从样品中提取的40μg蛋白质进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移到PVDF膜（碧云天生物技术研究所，上海，中国）。膜含5%脱脂奶粉的TBST25°C孵育1h。），并分别包被HMGB1、TLR4、TLR9一抗（1:，细胞信号科技，波士顿，美国）4°C过夜。随后，HRP标记的抗鼠二抗（1:0，北京中山生物科技，北京，中国）室温孵育1h，用可视化增强化学发光检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，上海，中国）透视。使用MultiGaugeversion3.2软件分析条带。目标蛋白的表达被归一化到同一样品中GAPDH水平。
统计分析：如非另外指明，参数值表示为均值土SD。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Student-Newman-Keuls检验（q检验）。P0.05认为有统计学意义。
结果
HMGB1在急性坏死性胰腺炎（ANP）小鼠模型回肠中的表达：诱导ANP12小时后检测AP的严重程度和HMGB1表达。胰腺组织学检查显示ANP的诱导（图1）。雨蛙肽和LPS处理的小鼠均成功诱导ANP，结果显示腺体明显肿大，可见明显的脂肪坏死区。组织病理切片HE染色可见严重的间质水肿、胰腺充血、大量坏死腺泡细胞和细胞膜溶解。对照组胰腺组织形态正常。HMGB1mRNA水平和蛋白水平均在回肠组织中检测到表达。与PBS注射的动物相比，RT-PCR显示ANP小鼠HMGB1mRNA水平升高（图2a）。WB分析显示ANP组的HMGB1蛋白表达也高于对照组（图2b，c）。
点击可查看大图
抗HMGB1抗体治疗降低血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平：以前的研究报道了SAP患者血浆TNF-α、IL-6和IL-1水平的升高，这些炎性细胞因子与AP早期全身并发症的发生有关。本研究中ANP组血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著高于对照组（图3），与以前的报道一致。此外还研究了HMGB1中和抗体对这些细胞因子的可能影响。如图3所示，与ANP组相比，HMGB1中和抗体处理后小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低。
点击可查看大图
抗HMGB1抗体治疗改善ANP鼠肠粘膜损伤：回肠切片HE染色后光镜下观察（图4）。对照组回肠上皮细胞排列整齐，绒毛形态、长度、数目正常。ANP组肠黏膜损伤明显。以不规则、固有层脱落、短、少、裸露的绒毛为特征。此外，增加的潘氏细胞可以观察到更多的颗粒。与ANP组动物相比，HMGB1组的组织学检查显示相关的回肠黏膜损伤恢复，以不规则、固有层脱落等减少，相对正常的绒毛长度和完整性。同时，IgY组黏膜损伤与ANP组相似。
点击可查看大图
二胺氧化酶（DAO）是一种肠黏膜酶，在肠黏膜的成熟绒毛细胞中活性较高。肠粘膜损伤或坏死可诱导DAO进入血液，肠道屏障的破坏允许内毒素从肠道腔进入全身循环中。本研究以DAO和内毒素核心抗体作为肠屏障功能评价指标。结果表明，与对照组小鼠相比，ANP小鼠的血清DAO和内毒素水平升高（图5），证实AP小鼠存在肠黏膜屏障损伤。给予HMGB1中和抗体后，如图5所示，血清DAO和内毒素的水平显著下降。
点击可查看大图
前期研究表明肠上皮细胞凋亡也有助于黏膜屏障功能障碍。我们使用dUTP缺口末端标记（TUNEL）法研究了肠粘膜细胞凋亡。如图6a所示，观察到ANP小鼠粘膜细胞的数量显著增加。HMGB1中和抗体治疗减轻回肠粘膜细胞凋亡（图6a）。与对照组动物相比，ANP组TUNEL染色黏膜细胞的整体光密度（IOD）值增加（图6b）。这种差异有统计学意义。在抗HMGB1组凋亡的IOD值与ANP组相比降低（图6b）。
点击可查看大图
抗HMGB1抗体抑制TLR4、TLR9的表达升高：调查了包括HMGB1信号通路涉及的下游受体TLR4，TLR9（HMGB1的主要受体，在肠上皮细胞不同程度的表达）的表达。如预测，ANP组TLR4mRNA及蛋白表达较对照组均升高（图7a，8a、c）。TLR4已被证实参与了SAP的器官功能障碍和细菌移位，并可能触发炎症反应和防御感染的功能。与ANP组相比，HMGB1中和抗体降低TLR4在mRNA和蛋白水平的表达，而在IgY治疗AP小鼠中不变（图7a、8a、C）。
点击可查看大图
点击可查看大图
以往的研究表明，TLR9在胰腺本身免疫细胞中表达，TLR9拮抗剂可降低AP胰腺水肿、炎性浸润和凋亡。但TLR9在AP肠黏膜屏障功能障碍中的作用之前没有报道。在本研究中，ANP组TLR9mRNA和蛋白的表达均高于对照组（图7b和8a、d）。HMGB1中和抗体治疗TLR9mRNA和蛋白的表达较ANP组降低（图7b和8a、d）。与ANP小鼠相比，在抗HMGB1抗体处理的动物HMGB1mRNA表达水平变化不大（图7c），但WB显示HMGB1中和抗体处理小鼠HMGB1蛋白表达明显下降（图8a、b）。
综上，我们现在可以报告说在AP小鼠肠黏膜HMGB1、TLR4和TLR9表达升高。通过HMGB1中和抗体抑制HMGB1可改善肠黏膜屏障功能障碍，降低血清其他炎性细胞因子的水平，减少下游受体包括TLR4和TLR9表达。表明HMGB1作为一个治疗靶点和HMGB1阻断达到SAP肠黏膜屏障功能障碍保护的的潜在可能。
赞赏
当前时间： 
E-Mail: